Filtració de flux tangencial TFF combinada amb ultracentrifugació per a una preparació eficient de vesícules extracel·lulars petites

Les petites vesícules extracel·lulars (sEV) són vesícules a nanoescala secretades per cèl·lules que contenen àcids nucleics, proteïnes, molècules petites i altres components, i tenen un paper important en la comunicació intercel·lular. Les petites vesícules extracel·lulars tipus exosomes-comparteixen grans similituds amb les seves cèl·lules mare. En comparació amb les nanopartícules artificials, presenten taxes d'eliminació immune més baixes i una menor citotoxicitat, cosa que els converteix en candidats prometedors com a nous.vehicles de lliurament de fàrmacs in vivo. Gairebé tots els tipus de cèl·lules poden secretar aquestes vesícules, i la investigació sobre la seva aplicació com a portadors de fàrmacs s'està movent gradualment del laboratori cap a aplicacions clíniques. No obstant això,la producció a gran-escala continua sent un coll d'ampolla important.

 

Mètodes actuals per a l'aïllament de vesícules extracel·lulars

Els mètodes actuals d'aïllament de vesícules extracel·lulars inclouenultracentrifugació, centrifugació en gradient de densitat, cromatografia d'exclusió de mida{0} (SEC) i precipitació de polietilenglicol (PEG)..

La precipitació amb PEG ofereix un alt rendiment i un funcionament senzill, però està associada a una contaminació important per proteïnes no desitjades. La centrifugació del gradient de densitat i la cromatografia d'exclusió de mida-pot proporcionar productes d'alta-puresa, però la seva eficiència és relativament baixa i els processos requereixen temps-. La ultracentrifugació s'utilitza àmpliament, però el seu volum de processament està limitat per la capacitat de centrifugació, cosa que dificulta la seva ampliació.

 

Aplicació de la filtració de flux tangencial per a la separació sEV

La filtració de flux tangencial (TFF) ja s'ha aplicat a la separació de nanopartícules com liposomes i vectors lentivirals. A TFF, l'alimentació flueix tangencialment a través de la superfície de la membrana, la qual cosa ajuda a reduir l'encrassement de la membrana i fa que el procés sigui més fàcil d'escalar.

Atès que les petites vesícules extracel·lulars generalment oscil·len entre30-200 nmde diàmetre, aCasset de membrana de 0,45 μmes pot seleccionar al sistema TFF per eliminar proteïnes i vesícules més grans, mentre que aCasset de membrana de 300 kDaes pot utilitzar per eliminar proteïnes-de petit pes molecular i concentrar les petites vesícules extracel·lulars presents al medi de cultiu.

 

Caracterització de la matèria primera després de la separació de TFF

L'anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA) va mostrar que els diàmetres de partícules es distribuïen principalment dins del rang de0-250 nm.

 

 

Tanmateix, la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) va revelar una gran quantitat de proteïnes contaminants, mentre que no es van observar vesícules extracel·lulars. Aquests resultats van indicar que es necessitava un pas addicional de purificació aigües avall per purificar encara més les vesícules extracel·lulars.

 

Caracterització del concentrat de TFF després d'ultrafiltració de 100 kDa

El concentrat de TFF es va processar posteriorment amb aTub d'ultrafiltració de 100 kDa.

NTA va demostrar que els diàmetres de partícules dels concentrats obtinguts després d'una i dues rondes d'ultrafiltració es van mantenir principalment dins del rang de0-250 nm. Tanmateix, la realització d'ultrafiltració dues vegades va donar lloc a una reducció significativa del nombre de partícules obtingudes.

L'anàlisi TEM va mostrar que no es van observar estructures semblants a vesícules-en els concentrats d'ultrafiltració d'una-o dos- vegada, mentre que quedava una quantitat considerable de proteïnes contaminants.

Per tant,La ultrafiltració de 100 kDa no es va poder utilitzar eficaçment per purificar el medi de cultiu després de la concentració de TFF.

 

 

Caracterització del concentrat de TFF purificat per ultracentrifugació

NTA va demostrar que els diàmetres de partícules dels productes purificats es distribuïen principalment dins del rang de0-250 nm.

És important destacar que el TEM va revelar clarament estructures semblants a vesícules-en diferents camps de visió. Aquests resultats van demostrar que després de concentrar el medi de cultiu amb TFF,La ultracentrifugació es pot emprar posteriorment per a una separació i purificació addicionals de vesícules extracel·lulars..

 

 

Caracterització de sEV aïllats del medi condicionat amb cèl·lules mare mesenquimals mitjançant TFF combinat amb ultracentrifugació

NTA va demostrar que els diàmetres de partícules dels productes purificats es distribuïen principalment dins del rang de0-250 nm.

Es van observar estructures semblants a vesícules- mitjançant TEM. L'anàlisi de Western blot va demostrar l'expressió positiva de les proteïnes associades a les vesícules extracel·lulars-CD9, CD63 i ALIXa les vesícules extracel·lulars purificades.

Aquests resultats van confirmar que les petites vesícules extracel·lulars purificades contenien exosomes, cosa que indica que aquest mètode també es pot utilitzar peraïllament i extracció d'exosomes.

 

 

Conclusió: TFF combinat amb ultracentrifugació per a la preparació de sEV d'alta-qualitat

L'estudi ho va demostrarConcentració de TFF solava donar lloc a un producte que contenia una quantitat considerable de proteïnes contaminants i, per tant, era insuficient per obtenir vesícules extracel·lulars qualificades.

De la mateixa manera, utilitzant aTub d'ultrafiltració de 100 kDa per a la purificació secundàriano va donar eficaçment estructures de vesícules intactes.

Combinant la concentració de TFF amb la purificació per ultracentrifugació posterior, es poden integrar els avantatges d'ambdues tècniques per obtenirproductes de vesícules extracel·lulars petites-d'alta qualitat.

En comparació amb la ultracentrifugació convencional sola, el procés combinat pot ser eficaçreduir el temps de processament global i millorar l'eficiència de la separació.

En aquest flux de treball,TFF permet un enriquiment ràpid de mostres de gran-volum, abordant la limitació de la ultracentrifugació convencional en el processament de grans volums de mostres. L'ultracentrifugació realitza una purificació profunda per eliminar les impureses de proteïnes co-concentrades alhora que ajuda a mantenir la puresa i la integritat de les vesícules.

A més, el procés no requereix l'addició dereactius de precipitació química exògena, ajudant a preservar l'activitat biològica de les vesícules en la major mesura possible.

Des de la perspectiva de la traducció industrial, aquest procés té significatiuaugmentar{0}}el potenciali pot ajudar a abordar els reptes associats amb la-producció a gran escala de vesícules extracel·lularslliurament de medicaments, medicina regenerativa i desenvolupament de productes relacionats. També proporciona una base experimental sòlida per a l'optimització de processos posteriors i la fabricació a escala pilot-.

 

Referència

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Establiment d'un mètode per a la separació de petites vesícules extracel·lulars mitjançant filtració de flux tangencial combinada amb ultracentrifugació. Revista xinesa de biologia, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.