Aplicacions experimentals i solucions de resolució de problemes per a tubs centrífugs d'ultrafiltració

Un tub centrífug d'ultrafiltració és un dispositiu de filtració de membrana d'ús habitual al laboratori. El seu component bàsic és una membrana d'ultrafiltració amb un tall de pes molecular específic. Els materials de membrana d'ultrafiltració comuns inclouen la polietersulfona (PES) i la cel·lulosa regenerada (RC). El principi de funcionament del tub centrífug d'ultrafiltració és utilitzar la força centrífuga i el tamisatge basat en la-mida-molecular per conduir molècules petites a través de la membrana d'ultrafiltració, permetent així una ràpida concentració, dessalació, intercanvi d'amortidors o purificació i separació de biomacromolècules com ara proteïnes i àcids nucleics.

 

Selecció MWCO

Proteïna	MWCO recomanat	Temps de centrifugació recomanat
6-20 kDa	3 kDa	40 min
20-30 kDa	5 kDa	30 min
30-60 kDa	10 kDa	20 min
60-100 kDa	30 kDa	20 min
100-200 kDa	50 kDa	15 min
200-600 kDa	100 kDa	15 min
>600 kDa	300 kDa	15 min
Molècules d'àcid nucleic simple- o doble-	MWCO recomanat	Temps de centrifugació recomanat
137–1159 pb	30 kDa / 100 kDa	10 min (rotor d'angle-fix, 5000 × g)
Nanoperles	MWCO recomanat	Temps de centrifugació recomanat
1,5-2 nm	3 kDa	40 min
2-3 nm	5 kDa	30 min
3-5 nm	10 kDa	20 min
5-7 nm	30 kDa	20 min
7-10 nm	50 kDa	15 min
10-30 nm	100 kDa	15 min
>30 nm	300 kDa	15 min

 

Per a les proteïnes, es recomana seleccionar un MWCO de membrana que sigui de 2 a 6 vegades inferior al pes molecular de la proteïna objectiu. Si també es considera el cabal, es recomana un MWCO de membrana per sota d'aquest interval de 2×–6×.

 

Cas d'aplicació (ADN de Shed Cells)

Per al mètode convencional, es va tallar un tros de gasa de 2,5 cm × 2 cm, es va lisar en un sistema de petit-volum i es va purificar directament amb l'instrument. Per al mètode de concentració, l'àrea de mostreig de gasa es va duplicar. Després de la lisi, el sobrenedant de la digestió es va transferir a un tub centrífug d'ultrafiltració de 100 kDa, concentrat per centrifugació a 10.000 r / min, recuperat per centrifugació invertida i després sotmès a extracció d'ADN mitjançant un instrument de purificació d'àcid nucleic totalment automatitzat. El volum d'elució es va establir uniformement a 40 μL per garantir que els nivells cel·lulars inicials dels dos grups fossin essencialment comparables.

 

Les proves quantitatives van mostrar que la concentració mitjana d'ADN era de 0,099 ± 0,041 ng/μL per al mètode convencional i de 0,193 ± 0,068 ng/μL per al mètode de concentració. La diferència entre els dos grups va ser estadísticament significativa (P <0,01). El rendiment total d'ADN obtingut amb el mètode de concentració va ser 1,95 vegades superior al del mètode convencional, demostrant que l'etapa de concentració d'ultrafiltració no va provocar gairebé cap pèrdua d'ADN total. Els valors de Ct dels dos grups van ser de 27, 64 ± 0, 39 i 27, 58 ± 0, 40, respectivament, amb P > 0, 01, cosa que indica que el tractament d'ultrafiltració no va introduir inhibidors de l'amplificació de PCR ni va interferir amb les reaccions d'amplificació posteriors.

 

Per al genotipat STR, es va definir un genotip complet per bandes completes a cada locus i una alçada màxima mitjana superior o igual a 200 RFU. Entre 20 mostres paral·leles, el mètode convencional va donar genotips complets per a només 14 mostres, mentre que el mètode de concentració va aconseguir un genotipat STR complet per a les 20 mostres, millorant significativament la taxa de detecció efectiva del genotipat de les mostres de contacte traces.

Els tubs centrífugs d'ultrafiltració de Guidling Technology presenten un funcionament senzill, factors de concentració elevats i altes taxes de recuperació de mostres, i s'utilitzen àmpliament en bioquímica, biologia molecular i altres camps. La taxa de recuperació dels tubs centrífugs d'ultrafiltració de Guidling Technology varia segons el material que s'està processant i, en general, pot superar el 90%.

 

Resolució de problemes comuns

Problema	Causa possible	Solució
La precipitació es produeix durant la concentració	La concentració és massa ràpida	Reduir la velocitat de centrifugació
		Utilitzeu un tub d'ultrafiltració amb un tall de pes molecular més alt
		Pipeteu cap amunt i cap avall al tub centrífug i, a continuació, torneu a centrifugar
	Sobre{0}}concentració	Es recomana que la concentració final de proteïnes després de la concentració no superi els 20 mg/ml
L'aigua no es pot filtrar	La membrana d'ultrafiltració està completament seca i la superfície de la membrana es torna dèbilment hidròfoba	Mulleu la membrana amb un dissolvent de baixa-tensió superficial- (p. ex., feu una centrifugació inicial amb etanol al 20% en aigua)
No hi ha cap proteïna objectiu present al concentrat	La concentració inicial de la mostra de proteïnes és massa baixa (< 25 μg/mL)	Si la concentració de la mostra és baixa i el volum és gran, carregueu repetidament la mostra i centrifugueu
	Selecció incorrecta de MWCO de membrana	El MWCO de membrana és generalment inferior a 2 vegades el pes molecular de la proteïna diana o més
	La força centrífuga està fora del rang especificat	Força centrífuga recomanada: 3000–5000 × g
	La proteïna objectiu ha precipitat	Ajusteu la concentració de proteïna objectiu al concentrat (ajusteu el factor de concentració)
		Controlar la temperatura i el pH
		Utilitzeu additius
		Ajusteu la força iònica
La interferència es produeix durant l'anàlisi aigües avall de la proteïna concentrada	La membrana d'ultrafiltració conté traces de glicerol	Pre-esbandiu el tub d'ultrafiltració amb tampó i aigua purificada. Si la interferència persisteix, netegeu amb NaOH 0,1 M, després esbandiu amb aigua purificada i assequeu-ho
Contaminació per RNases	No es garanteix que el tub d'ultrafiltració estigui lliure de-RNasa	Es recomana remullar en DEPC al 0,1% a 37 graus durant 2 hores per inactivar completament la RNasa; El DEPC residual es pot eliminar esbandint amb aigua purificada
Contaminació per endotoxines	Els tubs d'ultrafiltració subministrats no han estat sotmesos a tractament d'eliminació-d'endotoxines, i les endotoxines són àmpliament presents a la natura	Abans de l'experiment, pre-netegeu amb NaOH 0,5 M, seguit d'un esbandida amb aigua purificada per eliminar la majoria de les endotoxines.