Ultrafiltració de fibra buida de 300 kd: anàlisi d'un procés de concentració i purificació d'alta-eficiència per al virus O/A de la febre aftosa-i-

Introducció

La febre aftosa (FA) és una malaltia animal aguda, febril i altament contagiosa causada pel virus de la febre aftosa (FMDV). Aquest virus afecta els animals-ungulats, amb més de 70 espècies susceptibles. S'estén ràpidament i té una alta taxa de morbiditat, afectant típicament el bestiar principal com ara porcs, ovelles i boví, on la incidència pot arribar al 100%. El FMDV pertany al gènereVirus del peu-i-bocade la família MicroRNAviridae. Les partícules són esfèriques, d'aproximadament 27-30 nm de diàmetre, amb un coeficient de sedimentació de 146S per a partícules virals intactes. Actualment, hi ha diverses vacunes contra la febre aftosa, incloses vacunes de virus vius atenuats, vacunes de vectors de virus vius, vacunes inactivades, vacunes d'àcid nucleic, vacunes de pèptids sintètics i vacunes de subunitats. Les vacunes inactivades de la febre aftosa generalment tenen menys efectes secundaris en els animals, i les vacunes multivalents ofereixen una millor eficàcia d'immunització, cosa que les converteix en el pilar de la prevenció de la febre aftosa a la Xina.

Ultrafiltració de flux tangencial

Actualment, l'ultrafiltració de flux tangencial és un mètode de purificació i concentració d'ús habitual en la producció a gran-escala de vacunes inactivades multivalents contra la febre aftosa{{-{-. Aquest mètode no només aconsegueix el factor de concentració desitjat, sinó que també elimina una gran quantitat d'impureses estranyes. L'ultrafiltració de flux tangencial s'utilitza principalment per a la purificació, concentració i filtració (dessalació i substitució del tampó). A més, també es pot utilitzar per a la clarificació de brou de fermentació o medi de cultiu cel·lular mitjançant microfiltració de flux tangencial, substituint així la centrifugació o la clarificació primària.

En la filtració vertical convencional, les molècules grans tendeixen a agregar-se a la superfície de la membrana, obstruint el filtre. La filtració de flux tangencial, però, permet que el flux continuï paral·lel a la membrana, evitant aquest problema d'obstrucció. Durant la filtració de flux tangencial, el dissolvent i les substàncies més petites que la mida dels porus de la membrana que impregnen la membrana s'anomenen permeat, mentre que les substàncies més grans que la mida dels porus es conserven com a concentrat. Combinat amb processos de rentat i filtració optimitzats, es pot aconseguir la separació i purificació de molècules de diferents mides. Aquesta tecnologia ofereix avantatges com ara baix cost, condicions de funcionament suaus, neteja i substitució convenients, alt cabal de permeat de membrana i funcionament senzill, la qual cosa la fa especialment adequada per a la concentració i purificació a gran-escala de substàncies bioactives.

Materials i mètodes

Resultats i discussió

Pel que fa a la purificació inicial del virus, la concentració d'ultrafiltració aconsegueix una taxa d'eliminació superior al 90% per a impureses com les proteïnes que no contenen virus. En termes de volum, pot aconseguir concentracions elevades de 10 a 50 vegades, proporcionant un fort suport per a la purificació posterior. Es selecciona una columna de fibra buida amb un tall de pes molecular de 300 kd. Aquesta mida de porus, tot i que reté més del 85% del virus, pot eliminar més del 90% de les proteïnes impureses. L'àrea de la membrana és de 1600 cm² i el rendiment és de 2-5 ml/cm², la qual cosa permet que la concentració d'ultrafiltració es completi en un temps efectiu (en 2 hores). Les dades de purificació i concentració d'ultrafiltració detallades es mostren a la taula 1.

Taula 1. Resultats de la detecció total d'antígens de la febre aftosa (tipus O i A)

Consideracions sobre el mètode de purificació

Actualment, hi ha diversos mètodes de purificació, però fins i tot amb el mateix mètode per al mateix antigen, l'efecte de purificació sovint no és satisfactori per moltes raons, com ara la caracterització de l'antigen i els paràmetres del procés. Per exemple, els canvis en el disseny molecular aigües amunt o els sistemes de cultiu de fermentació poden alterar l'estructura molecular viral, donant lloc a resultats de purificació insatisfactoris. Els mètodes de clarificació inadequats poden augmentar els costos de la matèria primera o la quantitat de proteïna heteròloga, augmentant la pressió sobre la purificació aigües avall. La concentració d'ultrafiltració inadequada, com ara diferents mides de porus de la membrana d'ultrafiltració, factors de concentració i elució, cabals d'entrada, velocitats de filtració i TMP, poden provocar taxes de recuperació d'antigen baixes. Una pràctica àmplia demostra que una mala purificació pot causar reaccions adverses significatives en animals després de la immunització, que pot provocar la mort.